Progettazione di un formato di frammento anticorpale alternativo che può essere prodotto nel citoplasma di Escherichia coli

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 14188 (2023) Citare questo articolo

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Con una maggiore accessibilità e penetrazione nei tessuti, formati di anticorpi più piccoli come i frammenti di anticorpi (Fab) e i frammenti variabili a catena singola (scFv) mostrano il potenziale come scelte efficaci e a basso costo rispetto agli anticorpi a lunghezza intera. Questi formati derivati ​​dall’architettura modulare degli anticorpi potrebbero rivelarsi rivoluzionari per alcune applicazioni terapeutiche e diagnostiche. Gli ospiti microbici si sono rivelati estremamente promettenti come ospiti di produzione per formati di frammenti di anticorpi. Tuttavia, le basse rese proteiche target abbinate alla complessità del ripiegamento proteico comportano limitazioni nella produzione. Qui riportiamo un formato alternativo di frammento di anticorpo "FabH3" progettato per superare alcuni colli di bottiglia chiave associati alla piegatura e alla produzione di Fab. La molecola FabH3 si basa sul formato Fab con i domini costanti sostituiti da domini CH3 dell'immunoglobulina G1 (IgG1) ingegnerizzati in grado di eterodimerizzare in base all'approccio di guida elettrostatica. Mostriamo che questo formato alternativo di frammento di anticorpo può essere prodotto in modo efficiente nel citoplasma di E. coli utilizzando il sistema catalizzato di formazione di legami disolfuro (CyDisCo) in uno stato ripiegato in modo nativo con rese solubili più elevate rispetto alla sua controparte Fab e un'affinità di legame comparabile contro il antigene bersaglio.

Tra i prodotti bioterapeutici, il segmento degli anticorpi monoclonali (Mabs) detiene una posizione di mercato dominante, tuttavia questa tendenza sembra cambiare gradualmente con lo sviluppo di nuovi formati di anticorpi e di nuovi farmaci1. Gli anticorpi monoclonali a lunghezza intera hanno una lunga emivita circolante che potrebbe renderli inadatti per determinate applicazioni terapeutiche e diagnostiche2. Come potenziale soluzione, i frammenti di anticorpi (Fabs) sono emersi come attori chiave nell’industria biofarmaceutica. Offrono alcuni vantaggi come una migliore e profonda penetrazione nel tumore, il legame con epitopi specifici inaccessibili ai Mab, il legame dell'antigene monovalente con immunogenicità potenzialmente ridotta, una maggiore stabilità rispetto ai formati di frammenti anticorpali più piccoli e una clearance più rapida3,4,5. Una moltitudine di applicazioni di molecole basate su anticorpi come agenti terapeutici e diagnostici hanno intensificato la loro domanda e di conseguenza la necessità della loro produzione in rese elevate.

Molti prodotti biosimilari approvati e di tipo "me-too" sono stati prodotti in sistemi di espressione microbica di cui l'E. coli è rimasto una schiera di scelta6. Poiché i frammenti di anticorpi Fab e scFv non sono glicosilati e sono relativamente piccoli, la loro produzione in E. coli può essere più semplice ed economicamente più fattibile rispetto ai sistemi convenzionali di coltura cellulare di mammifero. I frammenti anticorpali sono proteine ​​legate da legami disolfuro che vengono tradizionalmente prodotte in modo ricombinante nel periplasma ossidante o come corpi di inclusione nel citoplasma riducente di E. coli. Tuttavia, entrambi gli approcci pongono ostacoli critici nella produzione efficiente di queste proteine ​​di interesse. L'espressione periplasmatica dei Fab spesso si traduce in basse rese proteiche, principalmente a causa della traslocazione proteica inefficiente e del piccolo volume del periplasma, mentre l'espressione citoplasmatica deve affrontare limitazioni in termini di degradazione proteica dello stato non nativo e aggregazione in corpi di inclusione. Dei sette Fab commercializzati, due sono prodotti nell'E. coli sotto forma di corpi inclusi3,7. Il ripiegamento Fab è un processo complesso, che coinvolge la formazione di legami disolfuro, l'isomerizzazione del prolilo cis-trans e l'oligomerizzazione controllata, e quindi il ripiegamento dei corpi delle inclusioni è spesso inefficiente e costoso8.

I frammenti Fab sono composti da due catene polipeptidiche legate covalentemente, vale a dire le catene pesanti (HC) e leggere (LC) che contengono rispettivamente due domini costanti CH1 e CL e due domini variabili che legano l'antigene VH e VL (Fig. 1A). Il dominio CH1 è una proteina intrinsecamente disordinata isolata e rimane in uno stato non ripiegato indipendentemente dalla formazione di legami disolfuro9. Uno dei passaggi critici che limitano la velocità nel ripiegamento dei frammenti anticorpali è l'associazione dei domini costanti poiché il dominio CH1 adotta il tipico ripiegamento dell'immunoglobulina (Ig) solo in seguito all'interazione con il dominio CL9,10. Inoltre, la bassa stabilità dell'HC unita alla formazione di dimeri LC legati covalente e non covalente garantisce la necessità di bilanciare la sintesi delle due catene11,12. Progettare e selezionare costrutti con diverse forze traslazionali di LC e HC per un'espressione Fab ottimale può essere laborioso, costoso e non necessariamente portare al successo. Esistono diversi approcci per favorire un'eterodimerizzazione efficiente in una molecola Fab, ad esempio Ojima-Kato et al. hanno riportato la fusione delle coppie di peptidi leucina-zipper nei domini costanti (Zipbody)13. Tuttavia, ciò limita l'applicazione terapeutica dei Fab a causa della necessità di passaggi di scissione del tag e dei conseguenti problemi di immunogenicità.